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复杂的水溶性多糖化合物

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琼脂糖
琼脂糖

琼脂糖(Agarose)是纯化的线性半乳聚糖亲水胶体,提取自琼脂或者含琼脂的海藻,结构上是一种线性聚合物,由β-D-吡喃半乳糖(1-4)连接3,6-脱水α-L-吡喃半乳糖基构成。简单地说,把琼脂中的琼脂果胶去掉,剩下的部分,就是琼脂糖。作为一种凝胶试剂,常用于通过凝胶电泳或者印迹法(如Northern或Southern)来进行日常核酸分析,也适用于蛋白应用,如辐射状免疫扩散(RID)实验。

琼脂糖基本参数

中文名称琼脂糖 英文名称Agarose
CAS9012-36-6、62610-50-8 EINECS232-731-8
分子式C24H38O19 分子量630.5471
熔点260-481.5℃ 相对密度1.81g/cm3

琼脂糖的化学结构

琼胶糖化学结构是由1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链构成 。

琼脂糖的凝胶性能

凝胶性能琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解,温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶,这是它具有多种用途的主要特征和基础。琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示。强度越高,凝胶性能越好。质量较好的琼脂糖强度通常在1200克/cm2以上(1%胶浓度)。琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致,凡是能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。琼脂糖具有亲水性,并几乎完全不存在带电基团,对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附,是理想的惰性载体。在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除,否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团,就会造成电内渗(EEO),电内渗对质点的移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低,通常在0.2%以下,电内渗比较小,通常在0.13以下。这也就是琼脂糖比琼脂贵那么多的原因了。

琼脂糖的特点

1、硫酸盐含量(sulfate content)——纯度指标,因为硫酸根是存在琼脂糖内的主要离子基团。

2、凝胶强度(gel strength)——施加于凝胶使之断裂的外力。

3、胶凝点(Gel point)——水溶性琼脂糖溶液冷却后形成凝胶时的温度。液体向凝胶转化的过程中,琼脂糖溶液具有滞后性,因此,胶凝点不等同于胶熔点。

4、电渗(EEO)——液体穿透凝胶的一种电动运动。琼脂糖凝胶内的阴离子基团吸附在基质上不会发生迁移,但是解离的阳离子就会朝负极迁移,从而产生电渗。由于生物聚合物的电泳迁移通常是朝负极运动,则EEO产生的内部对流会干扰分离效率。

琼脂糖的应用

1、琼脂、琼脂糖因为有特殊的胶凝性质,尤其有显著的稳固性、滞度和滞后性,并且易吸收水分,有特殊的稳定效应;已经广泛使用于食用、医药、化工、纺织、国防等领域,据不完全统计,琼脂、琼脂糖的用途已有1000多种,被国际上称为"新奇的东亚产品"。在食品工业中可用于生产:水晶软糖、定型软糖、水产品、肉类罐头、果汁饮料、果肉饮料、米酒饮料、乳品饮料、精品、乳品蛋糕。由于其良好的生物相容性又广泛用于生物分离介质的生产。

2、琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷,目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

琼脂糖在电泳技术上的应用

特点

天然琼脂(agar)是一种多聚糖,主要由琼脂糖(agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷,而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,由于这些基团带有电荷,在电场作用下能产生较强的电渗现象,加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此,目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下。

1、琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可以进行电泳。

2、琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大(约占98%~99%),近似自由电泳,样品扩散较自由电流,对样品吸附极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。

3、琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

4、电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。制成干膜可长期保存。

目前,常用琼脂糖作为电泳支持物,分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合,发展成免疫电泳技术,能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系,由于建立了超微量技术,0.1ug蛋白质就可检出。

琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸,如DNA鉴定,DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便,设备简单,需样品量少,分辨能力高,已成为基因工程研究中常用实验方法之一。

DNA电泳

琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型,同时与凝胶的浓度也有密切关系。

一、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

1、DNA分子的大小 在凝胶中,DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较,便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时,普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小,因此,就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时,分子大小不宜超过此值。

2、琼脂脂糖的浓度 如下表所示,不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

表 琼脂糖浓度与DNA分离范围

琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1

二、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

不同构型DNA的移动速度次序为:供价闭环 DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直线DNA>开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时,环状DNA(一般为球形)不能进入胶中,相对迁移率为0(Rm=0),而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0),由此可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度,但同时,也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。

三、电泳方法

1、凝胶类型

用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时,凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm,故又称为潜水式。目前更多用的是后者,因为它制胶和加样比较方便,电泳槽简单,易于制作,又可以根据需要制备不同规格的凝胶板,节约凝胶,因而较受欢迎。

2、缓冲液系统

缺少离子时,电流太小,DNA迁移慢;相反,高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热,严重时,会造成胶熔化和DNA的变性。

常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE),Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等,浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液,临用时稀释到所需倍数。

TAE缓冲能力较低,后两者有足够高的缓冲能力,因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀,为避免此缺点,室温下贮存5×溶液,用时稀释10倍0.5×工作溶液即能提供足够缓冲能力。

3、凝胶的制备

以稀释的电极缓冲液为溶剂,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入水平胶框或垂直胶膜,插入梳子,自然冷却。

4、样品配制与加样

DNA 样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解,缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料,含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油,以增加其比重,使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带,可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。

5、电泳

琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果较好。在低电压条件下,线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是,在电场强度增加时,较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高,电泳分辨率反而下降,为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不宜高于5V/cm。

电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳,只有当凝胶浓度低于0.5%时,为增加凝胶硬度,可在4℃进行电泳。

6、染色和拍照

常用荧光染料溴乙锭(EB)染色,在紫外光下观察DNA条带,用紫外分析仪拍照,或用凝胶成像系统输出照片,并进行有关的数据分析。

转移电泳

生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行分子杂交,但琼脂糖不适合于进行杂交操作,1975年,Southren创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC膜)上,再进行杂交的方法,被称为Southren印迹法。随后,Alwine等将类似方法用于RNA印迹,被戏称为Northern印迹,1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置,将蛋白质转移到膜上,再与相应的抗体等配体反应,被戏称为Western印迹,这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状,用低电压高电流电泳完成转移。1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上,称Eastern印迹。

目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售,使印迹转移速度快效率高、重复性好,应用更加广泛。聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳,但转移蛋白质时,凝胶中不可含有SDS、尿素等变性剂。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择,近些年用尼龙膜较多,因为尼龙膜机械性能好,烘烤不变脆,使用时比硝酸纤维素膜更方便。

进行印迹转移电泳时,要注意缓冲液的离子强度要低,pH要远离pI,使蛋白质带有较多电荷,一般用稳定性较好的Tris-缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间有能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度,但亦会增加热效应,故电压或电流不可过高。

凝胶电泳

一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中,DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时,在电场作用下,迫使DNA变形挤过筛孔,而沿着泳动方向伸直,因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向,则DNA分子必须改变其构象,沿新的泳动方面伸直,而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。1983年Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间(外推为0的滞留时间)与DNA分子大小有关的特性,设计了脉冲电场梯度凝胶,交替采用两个垂直方向的不均匀电场,使DNA分子在凝胶中不断改变方向,从而使DNA按分子大小分开。后来Carle等改进了电泳技术,并发现周期性的反转换电场(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通过电泳分开。电泳系统是由一水平式电泳槽和两组独立、彼此垂直的电极组成,一组电极负极为N,正极为S;另一组负极为W,正极为E。一块正方形琼脂糖凝胶板(10cm*10cm或20cm*20cm)呈45度放中央。电场在N-S和W-E之间交替建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大小有关。

电泳时,DNA分子处在连续间隔交替的电场中。首先向S极移动,然后改向E极。在每次电场方向改变时,DNA分子就要有一定的时间松弛,改变形状和迁移方向。只有当DNA分子达到一定构型后,才能继续前时。DNA分子净移动方向与加样线垂直,使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万碱基对的大分子DNA。较新式的仪器电极间的角度和脉冲时间均可调,使用更加方便。

此外,琼脂糖平板常用于免疫扩散技术的电泳技术相结合的多种免疫电泳。

琼脂糖的运输与保存方法

室温运输和保存即可。

使用琼脂糖的注意事项

1、可用煮沸或微波加热的方法来熔胶,琼脂糖熔化必须彻底。熔胶可能会引起暴沸,需注意防止烫伤。

2、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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